PLAN: La Fécondation

La Fécondation: 24 H après l’ovulation au maximum

1. Introduction.
2. La Maturation épididymaire du spermatozoïde (fécondance du spermatozoïde).

Introduction

Les gamètes matures: les spermatozoïdes et l’ovocyte.
La fécondation a lieu dans la trompe utérine.
Les différentes étapes de la fécondation suivent une chronologie extrêmement précise.

La fécondation correspond à la rencontre et à la fusion du gamète mâle et du gamète femelle donc fusion entre un spermatozoïde et un ovocyte mature pour donner une cellule totipotente qu’on appelle le zygote qui donnera l’embryon (formation de l’embryon = formation des différents tissus et des organes d’un individu dans une espèce déterminée).
On appelle encore l’étape de fusion des gamètes, l’interaction gamétique (interaction spermatozoïde-ovocyte pour former le zygote).

Les spermatozoïdes

Les spermatozoïdes sont des millions dans un éjaculat (20 millions), et quelques dizaines autour de l’ovocyte.
Il y a un phénomène de sélection quantitative important de spermatozoïdes entre le site d’émission et le site de fécondation. Cette sélection quantitative s’accompagne d’une sélection qualitative pour obtenir les spermatozoïdes de qualité optimale.

Ce sont des cellules haploïdes (23 chromosomes) mais aussi des cellules capacitées.
Ils ont subis le phénomène de capacitation qui se caractérise par des modifications membranaires et par une hyperactivation en termes de mobilité. Petite taille (55 µm) des spermatozoïdes (120 µm pour l’ovocyte ou 150 µm pour l’ovocyte si on inclut la ZPO.

Les spermatozoïdes sont caractérisés par un cytoplasme réduit et une chromatine très condensée (de par la présence des protamines et la mise en place de ponts disulfures entre les cystéines des protamines).
La production des spermatozoïdes chez l’homme est continue de la puberté à la sénescence.

L’ovocyte

L’ovocyte est une cellule de grande taille (diamètre de 120 μm sans la ZPO et 150 μm avec la ZPO), bloquée en métaphase 2.
L’ovocyte possède un globule polaire au niveau de l’espace périvitellin entre la ZPO et la MP.
Le noyau de l’ovocyte a une chromatine plutôt décondensée par rapport à celle du spermatozoïde. L’ovaire est coiffé par un pavillon qui va « aspirer » l’ovocyte dans la trompe utérine.

Les différentes étapes de la fécondation

1. Le spermatozoïde doit être mature: maturation épididymaire (10-15J). Les spermatozoïdes que l’on retrouve dans la lumière des tubes séminifères ne sont pas aptes à féconder, ne sont pas fécondants: les cellules de Sertoli vont phagocyter la goutelette cytoplasmique restante.
2. Capacitation et hyperactivation du spermatozoïde (contemporain de la capacitation).
3. Interaction du spermatozoïde – cumulus Oophorus.
4. Interaction spermatozoïde – zone pellucide ovocytaire.
5. Modification de l’acrosome et réaction acrosomiale pour permettre la traversée de la ZPO.
6. Traversée de la ZPO.
7. Fusion spermatozoïde – oeuf.
8. Activation de l’oeuf.
9. Réaction corticale (golgi) et blocage de la polyspermie: mécanismes de défense pouvant être surpassés si trop de spermatozoïdes.
10. Décondensation du noyau du spermatozoïde dans l’ooplasme (= cytoplasme ovocytaire).
11. Achèvement de la mitose et développement des pronucléi (pro noyau mâle et femelle).

La Maturation épididymaire du spermatozoïde (fécondance du spermatozoïde)

- L’épididyme est un long canal non droit car pelotonné situé à la sortie du testicule donc lorsque la spermatogenèse a eu lieu, les spermatozoïdes vont être collectés dans les tubes séminifères d’un même lobule puis dans le tube droit qui va disperser les spermatozoïdes dans le rete testis: réseau de petits canaux à l’intérieur desquels les spermatozoïdes vont transiter pour aller se jeter dans les tubes ou cols efférents qui vont eux-mêmes se jeter dans l’épididyme dont la portion initiale s’appelle la tête de l’épididyme ( 3 parties: tête, corps, queue qui est suivie du canal déférent). - Tubes séminifères tube droit rete testis tubes (cols) efférents tête-corps-queue de l’épididyme canal déférent canal éjaculateur fusionnant avec les vésicules séminales - C’est donc pendant le transit dans le canal épididymaire, que les spermatozoïdes vont subir la maturation qui va leur permettre d’acquérir leur pouvoir fécondant, maturation qui se caractérise par: o l’acquisition de la mobilité fléchante o l’aptitude à se fixer à la zone pellucide ovocytaire (ZPO) - L’épididyme a plusieurs fonctions: o Fonction de transport des spermatozoïdes. o Fonction d’élaboration du liquide épididymaire o Fonction du stockage des spermatozoïdes dans la queue de l’épididyme (un bon nombre de spermatozoïdes vont mourir dans l’épididyme). - Pendant la maturation épididymaire, le spermatozoïde va subir des modifications structurales, biochimiques et métaboliques lui permettant d’acquérir la mobilité fléchante, l’aptitude à se fixer sur la zone pellucide ovocytaire et à la membrane plasmique ovocytaire, l’aptitude à féconder l’ovocyte et à assurer un développement embryonnaire normal.

Les modifications structurales

- Phénomène d’accentuation de la condensation de la chromatine du noyau du fait de la mise en place de ponts disulfures entre les cystéines des protamines. Ceci a pour but de protéger le patrimoine génétique paternel pendant le transit dans les voies génitales mâles et femelles. - Au niveau de l’acrosome, phénomène de maturation des enzymes acrosomiques (proacrosine et acrosine). - Au niveau cytoplasmique, en fin de spermatogenèse, les spermatides matures vont se détacher de l’épithélium séminifère et une bonne partie du cytoplasme des spermatides rondes va être éliminée sous la forme des corps résiduels au cours du processus de spermiation. Ces corps résiduels sont ensuite phagocytés par les cellules de Sertoli mais le cytoplasme du spermatozoïde n’est pas complétement éliminé. Au niveau de la pièce intermédiaire du flagelle du spermatozoïde, le reste du cytoplasme sous la forme de gouttelette cytoplasmique va disparaitre, pendant le transit épididymaire. - Au niveau de la membrane plasmique du spermatozoïde, on va avoir une réorganisation des lipides membranaires, avec une augmentation des stérols, diminution des phospholipides permettant la stabilisation membranaire des spermatozoïdes. - Au niveau de la mobilité, les spermatozoïdes vont acquérir la mobilité fléchante: o Acquisition progressive au cours du transit épididymaire o Ils sont immobiles au niveau des tubes séminifères o Au niveau de la tête, du corps et dans la queue de l’épididyme, les spermatozoïdes sont immobiles quand on les laisse dans le liquide épididymaire. o En revanche, si on retire le liquide épididymaire, les spermatozoïdes prélevés au niveau de la tête auront un mouvement de type vibratile (mobilité tremblante) et au niveau de la queue, ils auront une mobilité progressive et linéaire o Il y a dans le liquide épididymaire, un ou plusieurs facteurs qui empêchent la mobilité des spermatozoïdes. Sans ce phénomène d’immobilisation épididymaire, on ne pourrait pas avoir la maturation membranaire et cytoplasmique. Au niveau des facteurs biochimiques intervenant dans l’acquisition de cette mobilité fléchante: o AMPc intracellulaire dépendante o diminution du calcium intracellulaire o augmentation de pH intracellulaire o utilisation de la carnitine et l’acétylcarnitine: pour acquérir cette mobilité les spermatozoïdes vont prendre le substrat énergétique dans la carnitine ou l’acétylcarnitine contenue dans le liquide épididymaire. Pendant cette maturation épididymaire, on a des modifications membranaires qui vont permettre aux spermatozoïdes de: - Reconnaitre et se fixer sur la zone pellucide ovocytaire (ZPO) - Reconnaitre et se fixer à la membrane cytoplasmique ovocytaire Sur la membrane du spermatozoïde, on va retrouver différentes protéines à la fin de cette maturation épididymaire: - des protéines de la spermiogénèse (ZP3 qui reconnait une glycoprotéine de la zone pellucide). - des protéines qui vont protéger le spermatozoïde du phénomène de capacitation spontanée. Pendant le transit épididymaire, il va y avoir: - Une élimination des protéines mises en place pendant la spermatogenèse - L’adjonction de nouvelles protéines propres à l’épididyme - Des modifications des protéines membranaires par l’adjonction de résidus glycosylés.  Tout cela va modifier de la charge électrique membranaire pour stabiliser la membrane du spermatozoïde.  In fine, le spermatozoïde sera une cellule très résistante et aura une grande stabilité: « fécondance » du spermatozoïde. Durant ce transit épididymaire, l’acquisition de ces différentes propriétés intervient soit au niveau du corps de l’épididyme, soit au niveau de la queue selon les espèces: - Dans la majorité des mammifères, cela se fait au niveau de la queue de l’épididyme. - Dans l’espèce humaine: cela se fait à la jonction tête-corps de l’épididyme. Ensuite, il y a des modifications que vont subir les spermatozoïdes dans les voies génitales féminines: la capacitation. - La capacitation: o modifications fonctionnelles et sélection quantitative (on sait qu’il y a 99,9 % des spermatozoïdes qui vont être éliminés au cours de tout le transit). o sorte de « décongélation » de la membrane plasmique Il existe une hétérogénéité des spermatozoïdes: o Tous les spermatozoïdes ne seront pas capacités o Beaucoup meurent avant d’être capacités o Difficulté de faire la différence entre spermatozoïde sénescent et spermatozoïde capacité. Cette préparation des spermatozoïdes est nécessaire pour avoir de taux de reproduction normaux. La capacitation est l’ensemble des transformations qui vont intéresser le spermatozoïde et lui permettre la reconnaissance et la fixation à la ZPO. Cela est caractérisé par le changement de la mobilité du spermatozoïde: hyperactivation: il va beaucoup plus vite lorsqu’il est capacité. Cette capacitation a lieu dans les voies génitales féminines. Pour que les spermatozoïdes puissent être capacités il faut qu’ils soient isolés du liquide séminal dans lequel il y a des facteurs qui empêchent la capacitation spontanée des spermatozoïdes. Cette séparation spermatozoïde-liquide séminal va se faire lorsque les spermatozoïdes vont transiter depuis le vagin vers la cavité utérine: ils vont traverser le col de l’utérus, dans une substance qu’on appelle la glaire cervicale. Cette traversée de la glaire cervicale constitue un premier filtre de sélection de la quantité des spermatozoïdes et des spermatozoïdes les plus mobiles. C’est dans l’utérus et dans les trompes que la capacitation va avoir lieu. Pour avoir une capacitation, il faut une élimination préalable du plasma séminal. En fonction de la période du cycle menstruel où l’on va se trouver, ce phénomène de capacitation va avoir lieu ou pas: - pendant la phase folliculaire, la capacitation a lieu lentement dans les voies génitales féminines - durant l’ovulation, la capacitation est accélérée et rapide. - en phase lutéale, la capacitation est absente. Cette capacitation a été étudié: in vivo et in vitro In vivo: - Migration antéro équatoriale des protéines - redistribution des spermatozoïdes, - perte et adjonction des protéines - Enlèvement des protéines de revêtement de la MP GAG - Enlèvement du cholestérol de la Membrane Plasmique Albumine + lipoprotéine LDH - Modifications des chaines oligosaccharidiques - Entrée du calcium à l’intérieur du spermatozoïde pour augmenter cette mobilité. Le calcium est un facteur dans toutes les étapes préparant la fécondation et pendant la fécondation. - Ces enlèvements de protéines vont permettre une mobilité et une redistribution de protéines membranaires avec un phénomène de migration antéro-postérieure, avec une libération d’espace membranaire dépourvu de protéine dans la tête du spermatozoïde.  Cet enlèvement des protéines de revêtement de la Membrane Plasmique se fait grâce aux glycosaminoglycannes qu’on va retrouver dans les voies génitales féminines et qui vont se fixer sur les protéines spermatiques avec des récepteurs pour les glycanes qui vont entrainer le décrochage des protéines membranaires. Ceci est facilité par l’albumine et par le pH utérin (inférieur à 6,5) = pH acide.  C’est la présence d’albumine et de lipoprotéine HDL qui vont permettre l’enlèvement du cholestérol de la Membrane Plasmique spermatique lui permettant une plus grande mobilité.  Les modifications des chaines oligosaccharidiques favorisent l’entrée du calcium et possible grâce à la présence d’enzymes génitales spécifiques. In vitro, on peut reproduire le phénomène de capacitation en faisant incuber les spermatozoïdes dans des milieux contenant: - de l’albumine stérique - de l’héparine - des accepteurs de cholestérol (albumine, lipoprotéines HDL). - de fortes concentrations en spermatozoïdes dans le liquide séminal car il y a dans le liquide séminal des facteurs d’inhibition de la capacitation or des concentrations élevées en spermatozoïdes finissent par dépasser les capacités inhibitrices du liquide séminal et on a des phénomènes de capacitations spontanées. De la même façon, cet effet inhibiteur du liquide séminal est temps-dépendant: au bout de 1 heure à 10 heures après incubation dans le liquide séminal on peut avoir des phénomènes de capacitations spontanées qui ne sont pas exceptionnels, sachant que de manière physiologique les spermatozoïdes restent très peu de temps avec le liquide séminal. - Les conséquences de cette capacitation: o L’augmentation de l’accessibilité des récepteurs spermatiques à la zone pellucide o L’augmentation de la perméabilité du calcium (donc augmentation du calcium intracellulaire) qui va permettre au spermatozoïde d’être hyperactif ; (capacitation = diminution Ca2+ ) - L’augmentation de la fluidité membranaire (par perte de cholestérol et par redistribution des protéines): mouvements des protéines membranaires. o Modification de la mobilité du spermatozoïde. o Migration o Ces propriétés acquises au cours de la capacitation vont permette 2 actions: o La réaction acrosomique ou acrosomiale est permise par:  L’accessibilité des récepteurs spermatiques à la ZPO  L’augmentation de la perméabilité au calcium hyperactif o l’hyperactivation des spermatozoïdes est permise par:  L’augmentation de la fluidité membranaire et  La modification de la mobilité des spermatozoïdes Les changements métaboliques et biochimiques: - Le spermatozoïde capacité est un spermatozoïde qui va avoir un métabolisme modifié. Il va y avoir: o une augmentation de l’activité métabolique o L’augmentation de la perméabilité aux ions calcium intracellulaire. o L’élévation du pH interne - Autres types de modifications: ce sont des modifications qui vont intéresser le noyau du spermatozoïde: la capacitation va entrainer l’augmentation de la stabilité du noyau (pourtant déjà très stable), stabilisé par des ponts disulfures, par la fixation du Zn2+ contenu dans le liquide séminal au niveau des ponts disulfures. - Au niveau de la composition des enzymes de l’acrosome, pendant la capacitation: o les précurseurs d’enzymes contenues dans l’acrosome vont donner les enzymes donc certaines enzymes vont devenir actives comme la proacrosine qui donne l’acrosine (en présence de glycosaminoglycannes). o mais il n’y a aucun changement majeur de la forme de l’acrosome. - Ce qui est témoin de cette capacitation est le mouvement caractéristique du spermatozoïde, qui avait un mouvement frénétique avant la réaction acrosomiale, caractérisé par: o Une augmentation du déplacement linéaire o une augmentation de l’amplitude de déplacement linéaire du flagelle o une augmentation de l’AMP cyclique intracellulaire avec hydrolyse d’ATP (utilise beaucoup de réserves énergétiques contenues dans ses mitochondries). Ce mouvement frénétique n’est pas infini. o une modification de la trajectoire. - L’hyperactivation est un processus physiologique: o Elle aide le spermatozoïde à nager dans le liquide utérin et dans le fluide tubaire o Elle joue un rôle important dans la traversée du cumulus et de la ZPO. Il faut savoir que le trajet des spermatozoïdes dans les voies génitales féminines n’est pas simple transit et beaucoup de spermatozoïdes vont se perdre dans les voies génitales féminines. o Corrélation directe entre mobilité grâce à l’hyper-activation et fécondation - Au cours de la capacitation: o Les modifications de la Membrane Plasmique de la tête vont préparer le spermatozoïde à la réaction acrosomiale et donc il y a la traversée de la ZP et fusion de l’ovocyte par le spermatozoïde. o Les modifications de la MP de la queue du spermatozoïde vont permettre l’hyperactivation physiologique et là aussi cela va permettre la traversée de la ZP et la fusion oeuf spermatozoïde. o Aide à se détacher de l’épithélium de l’isthme tubaire La rencontre des gamètes va avoir lieu dans la trompe utérine. Au moment de l’ovulation, le pavillon de la trompe utérine va coiffer l’ovaire et l’ovocyte ovulé va être capté à l’intérieur du pavillon et ensuite va migrer pour aller se positionner à la jonction ampoule tubaire (portion élargie) et isthme tubaire (région plus étroite). L’ovocyte va être arrêté à la fois par le rétrécissement du diamètre de la trompe et par la viscosité du fluide tubaire qui va le freiner à ce niveau. L’ovocyte ovulé va être entouré par le cumulus Oophorus et le plus près de la ZPO, on va trouver la corona radiata. L’ovocyte bloqué en métaphase de 2ème division méiotique est donc entouré par une partie des cellules de la granulosa qu’on appelle le cumulus Oophorus. Les spermatozoïdes vont devoir traverser ce cumulus Oophorus, - Le cumulus Oophorus  Cumulus = matrice + cellules o Matrice: constitué par de l’acide hyaluronique polymérisé et des protéines (collagène, laminine, fibronectine, etc.). o Cellules: possèdent des récepteurs à l’acide hyaluronique à leur surface (CD44) et des protéines à leur membrane (intégrines) ce qui permet d’assurer la cohésion des cellules du cumulus pendant la période qui précède la fécondation. o Le spermatozoïde va rentrer dans ces cellules du cumulus et permettre une dissociation du cumulus Oophorus pendant l’étape de la fécondation. Les mécanismes qui permettent aux spermatozoïdes de traverser cette ZPO sont un mécanisme enzymatique (dissociation récepteurs-ligands) et un mécanisme mécanique. Le principal événement qui permet aux spermatozoïdes de traverser le cumulus et la corona radiata est mécanique c'est-à-dire qu’ils vont rentrer par leur mouvement hyperactif (donc c’est plus un phénomène de réfraction et le mécanisme enzymatique secondaire à la réaction acrosomique va permettre la libération d’acrosine et de hyaluronidase contenu dans l’acrosome mais c’est 2ndaire). Lorsque les spermatozoïdes auront traversé le cumulus, ils vont arriver au niveau de la ZPO (pas qu’un seul: des centaines dans la traversée de l’utérus et les spermatozoïdes vont être relargués par dizaines à l’intérieur de la trompe utérine). - Origine et biosynthèse de la zone pellucide: la ZPO est produite exclusivement par l’ovocyte: o Des ovocytes en culture peuvent synthétiser toutes les glycoprotéines de la ZP o Acide hyaluronique en surface - La synthèse et la sécrétion des composants de la ZPO débutent très tôt au cours de la folliculogénèse et ovogénèse. - Reconnaissance- fixation à la zone pellucide: o Les glycoprotéines de la Zone pellucide sont au nombre de 3: la ZP1, ZP2, ZP3: elles sont spécifiques d’une espèce. Entre ces glycoprotéines, on trouve l’acide hyaluronique. ZP1 dans l’espèce humaine s’appelle la ZP4. Ces glycoprotéines vont s’organiser en chaîne pour constituer la zone pellucide ovocytaire grâce à la ZP1 ou ZP4 (chez l’homme) qui relie ZP2 et ZP3 o Le spermatozoïde va posséder des récepteurs qui vont reconnaitre les ligands que représentent la ZP2 ou la ZP3:o La ZP3 (ligand primaire): - constitue le premier ligand qui va être reconnu par le spermatozoïde - se lie à un récepteur membranaire spermatique qui se situe au-dessus du capuchon acrosomial. - cette liaison intervient avant la réaction acrosomiale. o La ZP2 (ligand secondaire): - va se lier à un récepteur spermatique qui va être retrouvé au niveau: se lie à la membrane acrosomique interne du spermatozoïde. - Cette interaction ne peut intervenir qu’après la réaction acrosomiale. o Le spermatozoïde se fixe d’abord à la ZP3 et cette première fixation déclenche la réaction acrosomique et ensuite, il y a fixation à la ZP2 et on va avoir un phénomène de d’accrochage-décrochage (dissociation ligand-récepteur) successif au niveau des ligands ZP2 et des récepteurs spermatiques pour permettre la traversée de la ZPO. o Au niveau du spermatozoïde, les récepteurs qui permettent l’interaction avec la ZP3 sont des enzymes membranaires, spécifiques d’espèces. On a identifié plusieurs dans l’espèce humaine et dans d’autres espèces tel que: o La Galactosyltransférase (Homme, lapin, taureau...) o La D-Mannosidase (Homme, Souris.) o Les LectinesCes enzymes membranaires sont situés au niveau de la membrane plasmique périacrosomique, dans la partie antérieure de la tête spermatique et vont se fixer aux chaînes oligosaccharidiques de la ZP3 Ceci va être responsable de la réaction acrosomique, caractérisée par la fusion de la membrane acrosomique externe et la Membrane Plasmique du spermatozoïde: - Cette réaction acrosomiale va avoir lieu dans la partie antérieure de la tête spermatique. - On va observer au niveau de cette partie antérieure de la tête spermatique des points de fusion entre la Membrane Plasmique et l’acrosome qui vont créer des ouvertures qui vont permettre la libération des enzymes contenues dans l’acrosome. - On a d’abord des fusions en différents points de la membrane acrosomique externe et de la Membrane Plasmique puis une augmentation des nombres de points de fusion et enfin une disparition dans la partie antérieure de la membrane plasmique et de la membrane acrosomique externe. Les conséquences vont être une externalisation des enzymes contenues dans l’acrosome et une libération de la membrane acrosomique interne qui va permettre d’extérioriser les récepteurs spermatiques au ligand que représente la ZP2. Au cours de la réaction acrosomique, on va observer: - une augmentation du calcium intracellulaire - une augmentation du pH intracellulaire - une déstabilisation des membranes acrosomiques externe et interne - une exocytose des contenus de l’acrosome, ceci accompagnant le phénomène de réaction acrosomique.  acrosine: 1) rompt liaison Sz-ZP3-ZP2 2) ne détruit pas la ZP 3) permet la fixation et le franchissement de la ZP mais ce n’est pas déterminant  hyaluronidase: 1) pas d’effet sur la corona radiata 2) détruit l’acide hyaluronique à la surface de la ZPO ce qui permet de faciliter le franchissement de la ZP (non déterminant également)  B N acétyl-glucosaminidase: 1) Franchissement ZP ++++ 2) rupture liaison SZ-ZP2-ZP3 - La traversée de la zone pellucide ovocytaire s’accompagne de la réaction acrosomique: o est déclenchée par la fixation du spermatozoïde au niveau de l’apex sur la ZPO et l’interaction avec la ZP3 de la ZPO. o L’ensemble aboutit à la fusion de la MP et la membrane acrosomique externe, la libération du contenu de l’acrosome et des autres récepteurs spermatiques qui vont se fixer ensuite à la ZP2 pellucidaire pour traverser cette zone pellucide. - Dissociation de la zone pellucide: 1. Rétraction 2. Enzymes acrosomiques 3. Traversée de la zone pellucide (s’effectue selon un trajet oblique). Les mécanismes impliqués dans cette traversée sont à la fois des mécanismes: o Physique, mécanique (Flagelle), liée à la vitesse de propulsion du spermatozoïde. o Enzymatiques (ZP2) par libération des enzymes contenues dans l’acrosome. - Cette ouverture est accompagnée par l’ouverture de canaux calciques responsables d’une élévation du calcium intra-spermatique. - Le mécanisme enzymatique est facilitant mais INSUFFISANT, c’est l’hyper-activation qui est la plus importante ! - Les étapes de la fécondation après la traversée de la ZPO: o Une fois que le spermatozoïde a franchi la ZPO, ce spermatozoïde va se retrouver dans l’espace périvitellin situé entre la ZPO et la MPO. o Ceci va précéder la fusion des gamètes qui correspond à la fusion de la membrane plasmique du spermatozoïde et de la membrane plasmique ovocytaire. o Ces fusions membranaires vont déclencher l’activation de l’ovocyte, synchrone de mécanisme de défenses de l’ovocyte face à la polyspermie. o L’ovocyte va réagir et provoquer la réaction corticale. Cette activation provoque l’achèvement de la méiose 2 bloquée autrefois en métaphase II et la formation des 2 pronoyaux in fine (paternel et maternel). (rappel: l’ovocyte non ovulé est bloqué en prophase I) - La fusion des gamètes fait intervenir 2 mécanismes successifs: o La reconnaissance des membranes plasmiques o La fusion des membranes plasmiques - La reconnaissance des membranes plasmiques fait intervenir des mécanismes moléculaires très généraux, non spécifiques à la fécondation que l’on peut rencontrer dans d’autres mécanismes de fusion membranaires tel que: o l’infection de cellules hôtes par des virus o la fusion des myoblastes pour former de cellules adultes plurinucléées. - Cependant des protéines spécifiques vont intervenir lors de cette fusion membranaire. Le spermatozoïde dans l’espace périvitellin va très rapidement se positionner tangentiellement par rapport à la membrane plasmique ovocytaire pour mettre en interaction les ligands et récepteurs issus de l’ovocyte et issus du spermatozoïde pour permettre ce mécanisme de reconnaissance qui déclenche la fusion. - Les protéines qui interviennent dans les mécanismes de fusion sont des protéines qui ont 2 domaines d’activité: o Un domaine de fixation: disintégrine o Un domaine de fusion: protéase - Ce sont des protéines de la famille ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease Domain) avec 2 sous-unités α et β: o une sous-unité α pour la fusion o une sous-unité β pour la fixation - On retrouve ces protéines spécifiques chez beaucoup de mammifères différents avec des propriétés comparables. - Ces protéines sont mises en place sur le spermatozoïde au cours de la spermiogénèse et vont être modifiées au cours du transit épididymaire: o α: Coupure du domaine Disintégrine qui permet la fusion. o β: Coupure du domaine Métalloprotéase qui permet la fixation. - La toute première protéine permettant cette fixation et fusion est la fertiline. - Ces protéines sont des protéines qui sont étudiées pour développer de nouvelles approches de contraception qui ne serait pas de type hormonale mais moléculaire et empêcherait l‘accessibilité à ses protéines par des moyens immunologiques. La pénétration du spermatozoïde dans l’ovocyte commence par la fixation qui va s’effectuer au niveau du segment équatorial où l’on voit se voit se libérer la membrane acosmique interne. Au niveau de la MP ovocytaire, on a des protéines de fixation de type intégrine qui va permettre cette interaction avec les disintégrines. - Au cours de la fusion des membranes, c’est un début au niveau du segment équatorial du spermatozoïde qui va permettre l’intégration complète de la membrane plasmique spermatique dans la membrane plasmique ovocytaire et en même temps cela va permettre au spermatozoïde de s’enfoncer dans le cytoplasme ovocytaire et de libérer l’ensemble de son contenu cytoplasmique dans le cytoplasme ovocytaire. - Les organites qui sont intégrés dans l’ovocyte vont être soit dégradés et recyclés soit en ce qui concerne les mitochondries d’origine paternelle vont être inactivées et seules les mitochondries maternelles vont être actives, donc nous héritons de mt de nos mères et s’il y a des anomalies de fonctionnement de ces mitochondries, ceci peut entrainer des pathologies qui vont intéresser la descendance de la femme: les embryons seront porteurs de cytopathies mitochondriale par altération des ADN des mitochondries. - Cette fusion des membranes entraine la mise en marche du premier cycle cellulaire activation ovocytaire: ensemble d’événements qui vont se traduire par des modifications morphologiques et moléculaires: o Modifications morphologiques: o Pénétration du spermatozoïde o Formation des pronoyaux o Emission de granules corticaux o Redistribution des organites intracellulaires liés à l’intégration des organites paternels avec une destruction d’une grande partie d’entre eux et une inactivation des mitochondries paternelles. o Modifications moléculaires qui sont caractérisées par: o l’élévation du calcium libre intra-ovocytaire o l’achèvement de la méiose 2 ovocytaire (2H après la fécondation) Dès qu’il y a fusion entre le spermatozoïde et l’ovocyte cela déclenche une augmentation rapide et transitoire de la concentration du calcium intracellulaire et cette augmentation transitoire fait intervenir le processus de fixation et de fusion membranaire, les protéines G, l’inositol triphosphate (IP3) provoquent la libération du calcium séquestré dans le réticulum endoplasmique lisse = réticulum sardoplasmique. - Oscillateur cytoplasmique et ses modulateurs: o Il y a certainement un facteur spermatique non identifié qui va déclencher le pulse. o Il y a des éléments qui vont intervenir au niveau de l’ovocyte lui-même: l’activation de l’ovocyte dépend de: o la maturité de cet ovocyte, o de la phase du cycle cellulaire dans lequel il va se retrouver, o de la qualité ovocytaire que l’on va voir.  Donc même si le facteur spermatique est présent, il ne va pas déclencher l’activation de cet ovocyte s’il est immature o il faut que cet ovocyte ait un récepteur permettant au spermatozoïde de se fixer (sensibilité des récepteurs). o il faut qu’il soit suffisamment mature pour permettre l’influx de calcium et, cela dépend des réserves de calcium dans le RE de l’ovocyte. Si l’ovocyte n’a pas suffisamment séquestré de calcium dans le Réticulum endoplasmique, même s’il y a le pulse sd spermatozoïde, les événements suivants ne vont pas se réaliser. - Au cours de la maturation ovocytaire pré-ovulatoire, on observe: o Cette augmentation de calcium de réserve intra-ovocytaire dans le RE o une augmentation de canaux calciques qui vont permettre l’influx calcique transmembranaire dans l’ovocyte. o Une réorganisation des organites (appareil de golgi, mitochondries et réticulum endoplasmique).  La maturation ovocytaire prépare l’ovocyte à être activé de manière correcte. Cette activation ovocytaire est dépendante de la phase dans laquelle l’ovocyte est situé: celui-ci doit être en phase M (mitose) pour que l’oscillateur calcique ait une efficacité maximale et donc ce doit être un ovocyte qui puisse redémarrer la division méiotique. L’augmentation du calcium va contribuer à l’activation du MPF également activé par la progestérone. L’activation du MPF va permettre l’activation de l’oscillateur calcique. Avec un ovocyte en interphase ou au stade de prophase 1, on n’aura pas d’activation de l’oscillateur calcique. Il y a un premier pulse de libération calcique qui va s’accompagner par des ondes successives de libération de calcium, ondes calciques qui vont débuter au point de fusion entre le spermatozoïde et l’ovocyte puis s’étendent sur tout l’ovocyte et redémarrent à intervalles régulier. L’amplitude des oscillations calciques donc des libérations successives de calcium sont dépendantes de l’espèce et des réserves calciques intra-ovocytaires. - La formation des 2 pro-noyaux 6 à 7H après la fécondation: PAS de fusion des 2 pro-noyaux o le spermatozoïde qui va être à l’intérieur du cytoplasme ovocytaire et surtout le noyau spermatique va subir des modifications qui vont intéresser l’organisation de sa chromatine. Ce spermatozoïde possède des nucléoprotéines basiques qui lui sont spécifiques, que l’on ne retrouve pas dans les cellules somatiques puisqu’il y a: o des histones de type somatique 20 % o mais surtout des protamines 70 % o et un peu de protéines intermédiaires ou de transition 10 % o On va avoir un phénomène de décondensation de la chromatine spermatique par un mécanisme inverse de celui qui a lieu au cours de la spermiogénèse: o disparition du zinc o disparition des ponts disulfures entre les cystéines des protamines o décrochages des protamines et des protéines de transition et o remplacement par des protéines histones de type somatiques pour former le pronoyau paternel par:  recondensation de la chromatine et  constitution de l’enveloppe nucléaire du pronoyau. o L’ovocyte, environ 2 heures après la fusion achève sa méiose 2. Il va achever sa métaphase 2 et expulse son 2ème globule polaire après quoi on va observer une migration des chromosomes maternels dans le cytoplasme ovocytaire. Les chromosomes vont se décondenser et s’entourer d’une enveloppe nucléaire pour former le pro nucleus femelle (plus petit que le pronucléus male). o 12 H après fécondation: réplication de l’ADN des pronoyaux o 18 H après fécondation: 2 pronoyaux symétriques au centre de l’ovocyte avec des COMT  SI asymétrie: pas d’organisateur nucléolaire Problème (mais symétrie que pour l’homme, d’autres espèces peuvent être asymétrique) o Chaque pronucléus va comporter 3 à 7 nucléoles dont la taille est comparable et qui sont extrêmement visibles et ces nucléoles sont les sites où vont être fabriqués les ARNr du futur embryon. L’ovocyte fécondé qui comporte les 2 pronoyaux porte le nom de zygote. o Les 2 pronoyaux se forment 6 à 7 heures après le début de la fécondation. Au début, ils auront une position périphérique, proche de la membrane plasmique ovocytaire, puis, au fur à mesure, ils vont migrer au centre du cytoplasme ovocytaire pour mettre en place du le premier fuseau de division de segmentation de l’embryon. On a donc: - Décondensation du noyau d’origine spermatique - (Re) Mise en place des histones de type somatique - Reconstitution de l’enveloppe nucléaire pour former le pronoyau male - Pour le noyau de l’ovocyte, achèvement de la méiose 2 - Expulsion du 2ème globule polaire - Migration des 2 pronoyaux vers le centre de l’ovocyte fécondé appelé zygote. De manière contemporaine, on va observer une modification des organites intracellulaires du zygote. La première modification va concerner les granules corticaux qui sont situés dans la zone corticale ovocytaire et qui comportent des enzymes. On va observer une exocytose des contenues des granules corticaux qui va commencer au point de fusion entre le spermatozoïde et l’ovocyte. Chez l’homme cela provoque l’imperméabilisation de la ZPO permettant d’éviter la polyspermie qui existe tout de même. La polyspermie est d’autant plus fréquente avec une mauvaise maturation du spermatozoïde et aussi avec le nombre de spermatozoïdes autour de l’ovocyte. Dans d’autres espèces, on a une imperméabilisation de la membrane plasmique (lapin par exemple). La redistribution des organites va aussi concerner les mitochondries et les centrioles: - les mitochondries: o Paternelles: dégradation ou inactivation des mitochondries o Maternelles: persistance des mitochondries dans l’oeuf Après la décondensation les mitochondries sont réparties uniformément dans le cytoplasme et ensuite lorsqu’il y a la formation des pronoyaux, les mitochondries vont se regrouper autour des pronoyaux et ensuite à chacun des pôles du fuseau de première division de segmentation pour permettre une répartition des mitochondries dans les 2 cellules embryonnaires qui vont se former après cette première division de segmentation. - Les centrioles: o L’ovocyte ne possède pas de centrioles. o Mais il faut qu’il y ait la formation d’un fuseau de division de segmentation. o Le spermatozoïde va apporter un centriole: le centriole proximal à cet ovocyte. Le centriole distal a contribué à la formation des structures du flagelle et a dégénéré. o le centriole proximal va fonctionner comme un centrosome donc un centre d’organisation centriolaire à partir duquel va se former un demi-fuseau de division mitotique formant le spermaster. Chaque nucléus possède 3 à 7 nucléoles. o Ce premier spermaster formé à partir du centriole paternel va activer le pronoyau femelle et va progressivement s’étendre à l’oeuf entier pour former d’autres microtubules pour dupliquer le fuseau et former un 2ème centriole. o Donc s’il y a des anomalies du centriole paternel, ceci va provoquer des anomalies de division de segmentation: dans les pathologies flagellaires, on peut observer outre l’absence de mobilité, des défauts de développement embryonnaire lié à des anomalies du centriole apportées par le spermatozoïde. A l’issue de cette redistribution des organites et à la formation du 1er fuseau de division de segmentation, on va observer un isolement des génomes donc: - Pas de fusion des 2 pronoyaux - une réplication de l’ADN: o indépendante et asynchrone pendant la migration l’une de l’autre c'est-à-dire qui ne se fait pas de manière synchrone dans les 2 pronoyaux o qui a lieu dans les pronoyaux avant même qu’ils ne soient au centre du cytoplasme ovocytaire donc pendant la migration de la zone sous-membranaire vers la zone centrale de l’ovocyte. - On aura un mélange des K paternels et maternels pour reconstituer les 2 premières cellules embryonnaires, chacune sera constituée par 46 K et une quantité 2n ADN. Même s’ils sont répartis dans les 2 cellules, les K paternels et maternels vont toujours rester isolés les uns des autres dans: o le zygote o le blastomère La première division mitotique se produira en moyenne 36 h après la fécondation et aboutira à un embryon à 2 cellules ou 2 blastomères. - Différentes anomalies peuvent intervenir lors de la fécondation: o La plus fréquente: la triploïdie qui peut être due: o à la polyspermie que l’on appelle aussi la diandrie: l’oeuf fécondé va avoir 3 pronoyaux: l’un d’origine maternel et 2 d’origines paternels ou un pronoyau avec un spermatozoïde diploïde donc due une fécondation par un spermatozoïde diploïde anormal o ou plus rarement, elle peut être d’origine maternelle par un défaut d’expulsion du globule polaire et on ce qu’on appelle la digynie, donc on aura 3 pronoyau avec l’un d’origine paternel et 2 d’origines maternels. o La Parthénogenèse: une activation du gamète femelle sans fécondation qui peut aboutir à la production d’embryon avec une reproduction monoparentale. Dans l’espèce humaine, la parthénogenèse n’aboutit pas à un embryon viable. Cependant les expériences de la pathogenèse, on permit de démontrer les phénomènes épigénétiques.

Enseignement Fécondation pour la faculté de médecine